金担子素A(AbA)助力酵母单/双杂交研究的筛选标记

金担子素A (Aureobasidin A，AbA)是从丝状真菌Aureobasidium pullulans No. R106中分离出来的环酯肽类抗生素，具有很强的抗真菌能力，在较低的浓度下(0.1-0.5 μg/mL)即可对酵母产生毒性。AbA作用机制是通过抑制酵母中AUR1基因编码的肌醇磷酰胺合成酶(inositol phosphorylceramide synthase, IPC synthase)的活性，阻碍神经酰胺到肌醇磷酰胺的合成，导致鞘脂类物质不足，细胞膜破裂，从而杀死菌株。对AbA敏感的的真菌种类包括：出牙酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和黑曲霉(A. niger.)。

图1 AbA结构式，CAS#127785-64-2

研究发现，酿酒酵母的AUR1基因与构巢曲霉的AURA基因具有同源性，都能编码IPC合成酶，因此，对这两个基因进行突变，能够赋予菌株很强的AbA抗性，比如：突变基因AUR1-C。AbA非常适合作为筛选阳性克隆的药物选择性标记，使用上也不需要优化条件，且背景极低。AbA抗性也是酵母单/双杂交研究中理想的报告子，兼容于携带相应抗性的酵母杂交系统。

酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid assay)是由Fields和 Song等人根据真核转录调控的特点创建的，能够快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用，在研究抗原和抗体相互作用、发现新蛋白质和蛋白质的新功能、筛选药物作用靶点、建立基因组蛋白连锁图等方面应用广泛。酵母双杂交原理是：真核生物的转录激活因子含有两个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA binding domain，DNA-BD)和DNA转录激活结构域(Activation domain，AD)，这两个结构域可以独立分开，功能互不影响。BD和AD分别单独作用并不能激活转录反应，只有当二者在空间上充分接近时，才呈现完整的转录激活因子活性，使下游基因得到转录。将两待研究蛋白（蛋白X与蛋白Y）分别与BD 、AD结构域构建融合质粒，转入同一酵母细胞中表达，如果两蛋白之间不存在相互作用，则报告基因不会转录表达；如果两个蛋白存在相互作用，则BD与AD两结构域空间上很接近，从而报告基因得到转录。

图2 酵母双杂交原理图[1]

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具，被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控，如鉴定已知DNA和已知蛋白质之间是否存在相互作用；分离结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点的新蛋白质；准确定位已经证实的具有相互作用的DNA结合位点和对蛋白质的DNA结合结构域进行分析。它的基本原理是将已知顺式作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter，Pmin)的上游，把报告基因连接到Pmin下游。将编码待测转录因子cDNA与酵母AD结构域融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活 Pmin启动子，使报告基因得到表达。

图3 酵母单杂交原理图[2]

针对酵母单/双杂交研究，翌圣生物推出产品60231ES Aureobasidin A (AbA)金担子素A，是溶于甲醇的AbA溶液，纯度 ≥ 97%，浓度为1 mg/mL。翌圣推荐在酵母单/双杂交实验中AbA抑制浓度为：100-1000 ng/mL，具体的工作浓度取决于宿主细胞的敏感度（见表1. AbA对各种酵母菌的最低抑菌浓度(MIC)）。

表1 Aureobasidin A对各种酵母菌的最低抑菌浓度

为研究GmWRKY31蛋白在GmSAGT1基因启动子上的结合位点，在酵母单杂实验中，将目的DNA序列插入到含有尿嘧啶报告基因Ura3的pBait-AbAi载体中，位于基因AUR1-C的上游，酵母转化相应质粒后悬浮在0.9% NaCl溶液中，OD600调整为0.005。随后，将100 μL样品涂于含500 ng/mL AbA的平板上，倒置，30℃下培养3-5天。[3]