一、鉴定目的蛋白表达
1、挑单菌落在氨苄(Amp，终浓度为 100g/mL)的 4mL LB 培养基中 37℃，250rpm 过夜培养。
2、将过夜培养菌液以 1:100 转接于含上述抗生素的 100mL LB 中，37℃，250rpm，3.5h（培养至 OD600＝0.6 左右）。
3、取出 1 mL 菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L，继续振荡培养 4h。
4、以未诱导菌液与 IPTG 诱导后菌液作对比，SDS-PAGE 检测。
二、蛋白表达是上清还是沉淀（而不是可溶不可溶，无论是上清沉淀均为可溶）
1、将上述的 37℃诱导菌液离心（4℃，12000g，5min），弃 上清（LB 培养液），沉淀重悬于 0.9% NaCl 溶液洗菌。
2、将重悬于 0.9% NaCl 的菌体溶液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（0.9% NaCl 洗菌液），得菌体，称菌体重量，重悬于 8mL PBS（pH 7.0）缓冲液，缓冲液用量根据 50~100mg/mL 的菌液终浓度。
3、超声破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声设置如下功率：400W，工作：15s，间隔：45s，全程时间：30min（30 次左右）以菌液由白变透
明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融 7 次以上效果也不错，而且简单，但是 DNA 出来后会粘稠，可能加 dna 酶后会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没加 dan 酶），不然分不开）4、将超声波破碎的菌液离心 （4℃，12000g，15min），分别收集上清和沉淀，各取 1mL，
加入 1mL 2×上样缓冲液，沸水浴 10min，SDS-PAGE 检测。
三、探索蛋白表达系统可溶表达条件
有上述实验结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性的表达，但是量很少，大部分也包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明了蛋白质表达量很高，上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶表达条件，最终来加大上清蛋白的含量，以利于下一步实验的进行。
影响包涵体形成的因素有很多，如诱导温度，诱导时间，IPTG诱导表达 浓度，摇床转速等等，所以设定在低 IPTG 浓度下（0.1 mmol/L），在不同温度，诱导时间下的表达对照：
1）37℃ 250rpm 5h
2）30℃ 180rpm 10h
3）23℃ 90rpm 30h
过程：挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为 100g/mL)的 3mL 液体 LB 培养基中 37℃，
250rpm 培养过夜。将过夜培养菌液以 1:100 转接于含上述抗生素的 50mL+50mL+60mL 液体 LB 中，37℃，250rpm，3.5h（大量培养至 OD600＝0.6 左右）。从 60mL 培养液中取 10mL 作为未诱导对照，标记 3 个 50mL LB 培养菌液：1、37℃ 250rpm 5h 2、30℃ 180rpm 10h 3、 23℃ 90rpm 30h都分 5 次取样：37℃ 每一小时取样一次（取 10mL）编号为：371、372、373、374、375 30℃ 每二小时取样一次（取 10mL）编号为：301、302、303、304、305 37℃ 每五小时取样一次（取 10mL）编号为：231、232、233、234、235
诱导培养结束后，将上述样品分别破菌离心，得上清与沉淀，加 2× 上样缓冲液，沸水浴
10min，SDS-PAGE 检测。
四、大量制备，蛋白表达与纯化
五、更多蛋白表达资料可访问德泰生物蛋白表达专题（http://www.detaibio.com/topics/dan-bai-biao-da.html）
配置 1L LB 液体培养基，分装成 100mL×10 瓶，分瓶以利于大肠杆菌生长和后续操作。诱导培养：挑取一单菌落接种于含氨苄 (Amp，终浓度为 100g/mL)的 3mL×5 管 液体 LB 培养基中 37℃，250rpm 培养过夜。将过夜培养菌液以 1:100 转接于含上述抗生素的 100mL×10 瓶液体 LB 中，37℃，250rpm，3.5h（大量培养至 OD600＝0.6 左右）。取出 1 mL 菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物 IPTG 至终浓度为 0.1 mmol/L，23℃，90rpm 条件下，继续振荡培养 20 小时。
破菌收集上清：分别离心（4℃，12000g，5min）加 8mL×10 管 PBS（pH 7.0）缓冲液重悬后，冰浴条件下超声波破碎（400W，15s，45s，30min），分别离心（4℃，12000g，15min）收集上清（8mL 左右×10 管）。
稀释过滤上清：将 8mL 左右×10 管菌液用 PBS（pH 7.0）缓冲液稀释为 2 倍，并过 0.45 纳米滤膜。取 1mL 留样。
过镍柱纯化：（8mL 左右×10 管×2 倍=160mL，分 2 次过柱，每次 80mL）
A、用缓冲液 I （PBS pH 7.0 缓冲液）平衡镍柱，5个床体积，流速为 2mL/min。
B、B、将稀释过滤后的上清上样，流速为 1mL/min。
C、用缓冲液 I （PBS pH 7.0 缓冲液）再洗 5 个床体积，流速为 2mL/min。使目标蛋白充分挂柱。
D、用含 50mM 咪唑的缓冲液 III，洗去杂蛋白，流速为 2mL/min。并收集洗杂峰。E、用含 100mM 咪唑的缓冲液 III，进行洗脱，流速为 1mL/min。并收集洗脱峰，收集洗脱液。
F、将收集的洗脱液用 15mL 超滤离心管分次超滤浓缩，收集各次浓缩液合并后再次超滤浓缩，分装成每管 1.5mL，取 1mL 4℃备用，其余-80℃保存。
G、各取 1mL 过柱前、挂柱穿透、洗杂液、洗脱液加 2×上样缓冲液，沸水浴 10min，SDS-PAGE检测。