标题：The m7G Methyltransferase Mettl1 Drives Cardiac Hypertrophy by Regulating SRSF9-Mediated Splicing of NFATc4

发表时间：2024.8.7

发表期刊：Advanced science

样品类型：小鼠心肌细胞

研究方法：m7G AlkAniline-Seq、m7G MeRIP-seq、RNA-seq等

心脏肥厚是导致心力衰竭（HF）的关键因素，但其发病机制尚未完全阐明。Mettl1催化的RNA n7 -甲基鸟苷（m7G）修饰与缺血性心脏损伤和纤维化有关。本研究旨在阐明Mettl1的作用及其在非缺血性心肌肥厚和心衰中的作用机制。研究发现，在横断主动脉收缩（TAC）和血管紧张素II （Ang II）输注后，Mettl1在人类衰竭心脏和小鼠肥厚心脏中上调。YY1在心肌肥厚过程中作为Mettl1的转录因子。敲除Mettl1可减轻TAC或Ang II刺激所引起的心脏肥厚及其功能障碍。相反，心脏特异性的Mettl1过表达会导致心脏重塑。从机制上讲，Mettl1通过诱导SRSF9 mRNA的m7G修饰增加SRSF9的表达，促进NFATc4的选择性剪接和稳定，从而加速心脏肥厚。此外，在体内和体外，敲低SRSF9可防止TAC或Mettl1介导的心脏肥厚。该研究确定Mettl1是心脏肥厚的关键调节因子，为心力衰竭提供了新的治疗靶点。

1.YY1诱导心肌肥厚过程中Mettl1表达上调

为了研究m7G甲基转移酶Mettl1是否参与心脏肥厚，我们评估了Mettl1在心力衰竭患者心脏中的表达。免疫印迹分析显示，与非衰竭对照组相比，衰竭心脏中Mettl1蛋白表达显著增加（图1A）。为了验证这一发现，我们建立了横断主动脉收缩（TAC）引起的心脏压力过载小鼠模型。如图1B所示，在肥厚心脏中，心肌肥厚基因表达上调，同时总RNA中m7G修饰水平升高。Western blot和qRT-PCR分析显示，与对照组相比，肥厚心脏中Mettl1 的mRNA和蛋白水平显著上调（图1C，D）。同样，与盐水处理的对照组相比，Ang II处理的小鼠心脏中Mettl1的mRNA和蛋白表达均升高（图1F，G）。此外，免疫荧光染色显示，在TAC上定位于心肌细胞，心肌蛋白Mettl1表达的增加，Mettl1与α-actinin共定位证明了这一点（图1E）。与体内结果一致，Ang II诱导的心肌细胞肥厚模型显示新生小鼠心肌细胞（NMCMs）中RNA m7G水平和Mettl1表达显著增加。这些发现提示Mettl1可能通过介导m7G修饰参与心脏肥厚过程。

随后，我们继续阐明心脏压力过载时Mettl1表达的上游机制。最近的一项研究发现反式转录因子1（SP1）和Yin Yang-1（YY1）是Mettl1的潜在转录因子。为了研究这一点，我们构建了YY1和SP1的siRNAs，并分别检测了敲除YY1或SP1后Mettl1表达的变化。在注入Ang II后的NMCMs中，YY1敲除后，Mettl1的mRNA和蛋白水平均显著降低（图1H，I）。然而，SP1的敲除对Mettl1的表达没有影响。这些结果提示YY1可能是Mettl1的一个转录因子。为了证实这一假设，我们构建了含有Mettl1启动子的荧光素酶载体，并将其转染到经Ang II处理的NMCMs中。荧光素酶分析结果显示，Ang II增加了Mettl1启动子活性，而沉默YY1后，这种活性显著降低（图1J）。此外，染色质免疫沉淀 （ChIP-qPCR）显示YY1与Mettl1启动子结合，在Ang II处理后相互作用增强（图1K）。综上所述，这些发现表明YY1在心肌肥大过程中作为上游调节因子激活Mettl1的表达。

图1：在肥厚小鼠心脏中，YY1转录激活Mettl1。

（A）Western blotting分析心脏组织中Mettl1蛋白水平。

（B）Dot blot分析心脏组织中m7G修饰水平。

（C）qRT-PCR分析Mettl1 mRNA水平。

（D）Western blot分析心脏组织中Mettl1蛋白水平。

（E）α-actinin和Mettl1染色的代表性免疫荧光图像。

（F）心脏组织Mettl1 mRNA水平的qRT-PCR分析。

（G）免疫印迹分析Mettl1心脏组织中的蛋白质含量。

（H）qRT-PCR检测NMCMs中Mettl1 mRNA的表达。

（I）NMCMs Mettl1蛋白水平的变化。

（J）NMCMs后的荧光素酶活性变化。

（K）YY1或IgG抗体进行ChIP-qPCR分析。

2.缺乏Mettl1可减轻心脏压力过载引起的心肌肥厚和心衰

为了研究Mettl1在心脏肥厚中的功能作用，我们制造了全身Mettl1基因敲除小鼠。虽然Mettl1杂合子敲除（Mettl1 KO）是存活和可育的，但与野生型（WT）小鼠相比，Mettl1 KO小鼠心脏Mettl1 mRNA和蛋白水平显著降低（图2A，B）。Mettl1 KO和年龄匹配的WT幼崽接受TAC处理诱导心脏压力过载，导致血流速度增加，证实了与心脏压力过载相同的水平。Mettl1 KO和WT小鼠在体重、心脏重量和心功能方面没有显著差异(图2C)。然而，在TAC处理 10周后，Mettl1 KO小鼠的心脏重量与体重之比（HW/WB）、心脏重量与胫骨长度之比（HW/TL）和肺重量与胫骨长度之比（LW/TL）相对于WT小鼠有所下降（图2D，E）。超声心动图分析显示，与WT小鼠相比，TAC处理后Mettl1 KO小鼠的心功能得到改善，射血分数（EF%）和缩短分数（FS%）增加。此外，TAC诱导的WT小鼠收缩期左室内径（LVID;d）、舒张期左室内径（LVID;s）和舒张期左室后壁厚度（LVPW;d）的增加幅度在Mettl1 KO小鼠中有所减弱（图2C）。小麦胚芽凝集素（WGA）染色显示，与WT小鼠相比，TAC处理后Mettl1 KO小鼠的心肌细胞横截面积（CSA）显著减少（图2F）。同时，与TAC处理后的WT心脏相比，Mettl1 KO心脏中心脏胎儿基因ANP、BNP和β-MHC/α-MHC的mRNA表达下调（图2H）。此外，Mettl1 KO心脏在TAC处理后表现出明显的心脏血管周围和间质纤维化减少，纤维化基因Col1a1、Col3a1、CTGF、α-SMA和纤维连接蛋白1 （Fn1）的表达减少，Col1a1和α-SMA的蛋白水平也降低（图2G，I，J）。

为了进一步研究Mettl1在心脏肥厚中的作用，将Mettl1 KO小鼠和WT对照小鼠进行为期4周的Ang II输注（每天2.5 mg kg−1）。经Ang II治疗后，Mettl1 KO和WT小鼠的体重、血压或心率均无显著差异。Ang II诱导了Mettl1 mRNA和蛋白表达的显著增加，而在Mettl1 KO小鼠的心肌中，这种表达有所减弱。超声心动图显示，Ang II后Mettl1 KO小鼠心功能障碍得到改善，EF%和FS%增加，LVID;s和LVPW;d降低。此外，与WT小鼠相比，Mettl1 KO小鼠表现出更少的心脏肥厚，心脏大小、HW/TL、LW/TL、HW/BW和心肌细胞CSA在Ang II后均减小。与这些发现一致，在Ang II后，Mettl1 KO小鼠的心脏胎儿基因表达比WT对照组低。这些结果表明，Mettl1缺乏可以防止压力过载时心脏重构和HF的发生。

图2：缺乏Mettl1可减轻心脏压力过载后的心肌肥厚和心衰。

（A）qRT-PCR分析心脏组织中Mettl1 mRNA表达的qRT-PCR分析。

（B）Western blot分析心脏组织中Mettl1蛋白水平。

（C）超声心动图测量的原始痕迹。

（D）sham和TAC处理小鼠心脏重量（HW）与胫骨长度（TL）的相对 比值。

（E）sham和TAC处理小鼠的相对肺重（LW）与胫骨长度（TL）之比。

（F）心室心肌细胞横截面积（CSA）的量化。

（G）sham和TAC组小鼠Masson染色。

（H-I）qRT-PCR分析小鼠基因变化。

（J）免疫印迹分析心脏组织蛋白质含量。

3.Mettl1驱动心脏重塑

上述结果提示进一步研究Mettl1的过表达是否可以复制在压力过载诱导的心脏重构中观察到的表型。我们采用了一种功能获得策略，使用腺相关病毒血清型9编码Mettl1转录物（AAV9-Mettl1），以AAV9载体作为阴性对照（AAV9-Null）。与AAV9载体处理的小鼠相比，AAV9-Mettl1处理导致Mettl1 mRNA和蛋白水平显著上调，达到与TAC处理的心脏相似的水平（图3A，B和1C，D）。值得注意的是，过表达Mettl1显著降低EF%和FS%，引起心脏扩张(图3C)。Mettl1过表达小鼠的心肌肥厚也很明显，LVPW;d、HW/TL和CSA的显著增加证明了这一点（图3C-E）。此外，我们评估了从AAV9-Null和AAV9 - Mettl1处理的小鼠中分离的成年小鼠心肌细胞的表面积。与AAV9 - null处理的小鼠相比，Mettl1过表达的心肌细胞表面积一致增加。同样，Mettl1过表达导致离体心肌细胞的宽度明显增加，长度适度增加。Mettl1过表达后心脏胎儿基因mRNA表达的显著升高进一步支持了这一点（图3F）。此外，Masson染色显示，Mettl1过表达诱导心脏纤维化，纤维化基因mRNA表达显著增加，Col1a1和α-SMA蛋白水平升高（图3G-I）。

接下来，我们进行了体外研究，探讨Mettl1在心肌细胞肥大中的作用。为此，在Ang II治疗之前，将靶向Mettl1的siRNA转染到NMCM中。siMettl1处理导致NMCM中Mettl1蛋白水平显著降低。免疫荧光染色检测到，通过敲低Mettl1可以阻止Ang II诱导的细胞增大。同样，Mettl1的敲低减弱了Ang II诱导的ANP、BNP和β-MHC mRNA表达的上调。相反，用含有Mettl1基因的腺病毒（Adv）感染NMCM，人工过表达Mettl1，会产生相反的结果。具体来说，Mettl1过表达导致心肌细胞肥大，心肌细胞大小、ANP和BNP mRNA水平增加。这些结果共同表明，Mettl1足以诱导心脏重构。

为了阐明Mettl1驱动心肌肥厚的机制，我们采用RNA-seq结合m7G MeRIP-seq，分别在Mettl1过表达的小鼠心肌和NMCM中进行全转录组分析和m7G位点定位。Mettl1过表达后，NMCM中总m7G甲基化水平更高，而Mettl1敲低则具有相反的效果。m7G MeRIP-seq分析显示，在过表达Mettl11的心脏中，有3085个上调基因和5372个高甲基化峰。此外，m7G峰值水平与基因表达之间的相关性表明，1520个上调基因的m7G修饰增加。在综合m7G MeRIP-seq和m7G AlkAnilineSeq结果后，我们发现566个重叠基因在过表达Mettl1后，m7G峰和mRNA表达增加（图4A）。KEGG分析表明，566个重叠基因主要富集于与心脏肥厚相关的信号通路，如AMPK、MAPK和mTOR通路。对566个重叠基因GO分析显示，参与的生物过程与心脏发育、血管生成和DNA损伤有关。此外，一些基因表现出蛋白质和核酸的结合能力。为了确定Mettl1的具体靶点，我们综合参考了KEGG和GO分析的结果，得出了14个可能参与心脏肥大相关途径的基因（图4B）。然后，我们评估了这些候选基因在TAC处理和过表达Mettl1的心脏中的表达，发现14个基因中有4个在两种情况下都表现出上调。此外，m7G MeRIP-qPCR结果显示，与抗IgG相比，抗m7G显著免疫沉淀m7G甲基化的SRSF9 mRNA在NMCM和小鼠心肌中，Mettl1过表达显著增强了这种富集(图4C)。相反，TAC诱导的SRSF9 mRNA m7G水平升高在Mettl1缺陷心脏中减弱。整合基因组分析显示，Mettl1过表达后，NMCM中m7G水平和SRSF9 mRNA表达显著增加（图4D）。为了评估Mettl1是否会影响SRSF9 mRNA的稳定性，我们在NMCM中进行了RNA衰减试验。结果显示，在放线菌素D处理后，Mettl1的敲低加速了SRSF9 mRNA的衰减，而Mettl1的过表达阻止了SRSF9 mRNA在心肌细胞中的衰减（图4E，F）。无论是否进行TAC处理，Mettl1 KO心脏的SRSF9蛋白表达均显著降低（图4G）。相反，Mettl1过表达显著升高SRSF9蛋白水平（图4H）。在体外NMCM中也观察到类似的结果（图4I，J）。

m7G AlkAnilineSeq分析显示，两个m7G峰位于SRSF9 mRNA的3'UTR上。此外，我们通过catRAPID数据库预测了Mettl1对SRSF9 mRNA的结合偏好，结果显示Mettl1对SRSF9 mRNA的3'UTR区域具有更强的结合偏好。为了进一步证实SRSF9是Mettl1的直接靶点，我们构建了一个包含野生型SRSF9编码序列（CDS）和3'UTR区域（SRSF9- wt）的质粒，以及一个突变型SRSF9 3'UTR （SRSF9- mut）质粒（图4K）。Western blotting证实两种质粒在NMCM中均显著过表达SRSF9。正如预期的那样，m7GMeRIP-qPCR结果显示SRSF9-WT能够被抗m7G免疫沉淀，而SRSF9-Mut则不能（图4L）。此外，Mettl1促进了转染的外源SRSF9转录物在SRSF9- wt处理的心肌细胞中的稳定性，而这种作用在SRSF9- mutt处理的心肌细胞中被消除（图4M）。这些结果表明Mettl1以m7G依赖性的方式调控SRSF9的表达。

5.缺乏SRSF9可抑制心脏重构

为了研究SRSF9在心肌细胞肥大中的功能，我们设计了三种不同的siRNA序列来沉默NMCM中的SRSF9。结果显示，用siSRSF9 2#处理后，SRSF9蛋白表达下调最为显著。SRSF9的敲低减弱了Ang II诱导的心肌细胞大小和肥厚基因表达的增加，而SRSF9的过度表达则显著增加了心肌细胞肥厚。为了证实我们的体外实验结果，我们进行了一项体内功能丧失研究，以探索SRSF9在心脏肥厚中的作用。为此，我们构建了一个携带SRSF9- shRNA片段的AAV9 (AAV9- shSRSF9)，在小鼠心肌中敲除SRSF9。小鼠接受相同水平的TAC处理，主动脉弓血流量增加。与AAV9-shSRSF9处理的小鼠相比，给予AAV9-shSRSF9可显著降低SRSF9 mRNA和蛋白水平，并显著消除TAC诱导的SRSF9表达升高（图5A，B）。超声心动图分析显示，敲低SRSF9可显著缓解TAC诱导的心功能障碍，降低心脏扩张，降低LVPW;d(图5C）。此外，SRSF9的敲除减弱了HW/TL和LW/TL的增加（图5D，E）。WGA染色显示，TAC诱导CSA显著增加，沉默SRSF9后CSA增加被消除（图5F）。与此一致的是，TAC诱导的心脏肥厚基因表达水平的增加可以通过敲低SRSF9消除（图5H）。此外，抑制SRSF9可降低TAC后心脏纤维化和纤维化基因的表达（图5G，I）。这些结果表明，阻断SRSF9可减轻压力过载时的心肌肥厚。

为了研究SRSF9过表达是否会导致与压力过载引起的心脏肥厚相同的表型，我们采用了功能获得法，通过感染AAV9-SRSF9及其阴性对照AAV9-Null。与AAV9载体处理的小鼠相比，AAV9-SRSF9处理导致SRSF9 mRNA和蛋白水平显著上调。值得注意的是，SRSF9过表达显著降低EF%和FS%，并引起心脏扩张。在SRSF9过表达小鼠中也观察到心脏肥厚，表现为LVPW;d、HW/TL和CSA的显著增加。结果进一步验证了这一点，过表达SRSF9导致心脏胎儿基因表达显著增加。

6.SRSF9通过调节剪接稳定NFATc4 mRNA

SRSF9是一种RNA结合蛋白，也参与RNA剪接。为了揭示SRSF9介导心脏肥厚的机制，我们基于ENCORI、catRAPID和KnockTF2.0三个数据库预测了可能与SRSF9结合的基因。如图6A所示，这些数据库的交集产生了已知与心脏肥厚有关的基因，包括EZH2、NFATc4、GATA4和JARID2。为了验证这些基因是否是SRSF9的靶标，我们在敲除SRSF9后测定了Ang II处理的NMCM中它们的mRNA表达。结果显示，Ang II使NFATc4 mRNA的表达升高最为显著，而SRSF9的敲低则显著降低了NFATc4 mRNA的表达（图6B）。相比之下，SRSF9过表达组的NFATc4 mRNA水平高于adv - null处理组（图6C）。Western blot结果显示，敲低SRSF9消除了Ang II诱导的NFATc4蛋白水平的升高，而过表达SRSF9则增加了NFATc4的表达（图6D，E）。同样，通过沉默SRSF9，TAC诱导的小鼠心脏中NFATc4 mRNA和蛋白水平上调被减弱，而心脏组织中SRSF9的过表达导致NFATc4表达显著上调。NFATc4已被证明通过易位进入细胞核促进胎儿基因的转录，从而促进心脏肥厚。因此，我们在处理SRSF9后检测了NFATc4在细胞核和细胞质中的分布。正如预期的那样，Ang II导致NFATc4的核积累，而SRSF9的敲低减轻了这种积累（图6F）。相比之下，SRSF9过表达导致细胞核部分NFATc4增加（图6G）。

鉴于SRSF9是一个剪接因子，我们推断SRSF9可能调控NFATc4的选择性剪接。为了验证这一假设，我们采用琼脂糖凝胶电泳检测了之前发现的两个NFATc4转录体变体的剪接率（PSI）。结果显示，敲低SRSF9可降低NFATc4长变体转录本（NFATc4- l）的PSI，提示SRSF9可能以一种内含子保留的方式促进NFATc4的剪接(图6H)。根据RBPmap数据库，我们在NFATc4的第9和第10外显子之间的第9内含子上预测了潜在的SRSF9结合位点（AGGAGAA和GGATGGA序列），用红色字体标记（图6I）。这促使我们验证SRSF9是否通过直接结合其pre-mRNA来调节NFATc4剪接。为此，我们构建了一个包含NFATc4 9 - 10外显子基因组DNA片段和内含子9的WT小基因报告质粒（NFATc4-WT）和一个在NFATc4结合位点突变的突变小基因报告质粒（NFATc4- mut）（图6J）。与转染的外源NFATc4- wt组相比，SRSF9结合位点的突变导致NMCM中SRSF9刺激的NFATc4内含子保留事件的富集减少，表明SRSF9以序列特异性的方式调节NFATc4剪接（图6J）。此外，RIP-qPCR实验表明外源NFATc4-WT可以与SRSF9结合，而外源NFATc4-Mut则失去了这种能力（图6K）。

为了进一步研究SRSF9对NFATc4转录变体mRNA水平上的影响，我们设计了两对引物，分别特异性扩增NFATc4-L或NFATc4的较短转录变体（NFATc4- s）。qRT-PCR结果显示，基线时NMCM中NFATc4-L的mRNA表达水平远高于NFATc4 pre-mRNA和NFATc4-S。值得注意的是，在TAC诱导的肥厚心脏中，NFATc4-L的表达显著上调，而SRSF9的沉默则减弱了NFATc4-L的表达。SRSF9过表达增加，而SRSF9敲低降低了NFATc4-L的mRNA表达(图6L,M)。此外，我们检测了NFATc4-L和NFATc4-S的mRNA衰减率，发现NFATc4-L的稳定性比NFATc4-S强得多，并且SRSF9的敲低加速了NFATc4-L的降解。为了进一步阐明SRSF9的哪个结构域负责调节NFATc4 pre-mRNA剪接，我们分别通过去除RNA识别结构域1和2 （Flag-SRSF9-ΔRRM1和Flag-SRSF9-ΔRRM2）构建了两个标记为SRSF9的flag标记截断。如图6N所示，SRSF9 RRM1结构域的缺失而非RRM2结构域的缺失显著抑制了NFATc4的选择性剪接。此外，当SRSF9在其RRM1结构域缺失时，SRSF9与NFATc4pre-mRNA的结合能力降低（图6O）。进一步的实验表明，RRM1结构域的缺失导致SRSF9丧失了调控NFATc4-L mRNA和NFATc4蛋白表达的能力（6P, 6Q）。综上所述，我们的数据表明SRSF9通过调节NFATc4 pre-mRNA的剪接来增加NFATc4蛋白的表达。

7.SRSF9介导Mettl1诱导的心肌肥厚

· Mettl1在人类衰竭心脏和小鼠肥厚心脏中表达升高，与RNA中m7G水平升高相关。

· YY1在心肌肥厚过程中作为Mettl1的转录激活因子。

· Mettl1在压力过载条件下驱动心脏肥大和重塑中起关键作用。

· 缺乏SRSF9对TAC手术具有心脏保护作用，可挽救mettl1诱导的心肌肥厚。
· Mettl1诱导SRSF9 mRNA的m7G修饰，增加SRSF9的稳定性，进而与NFATc4结合并剪接，导致促肥厚表型。

· 本文特色，关于m7G修饰的检测，研究者同时采用了抗体富集的方法m7G MeRIP-seq以及单碱基分辨方法m7G AlkAniline-Seq，实现对mRNA上ｍ7G位点的精确检测。

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